Bevezetés a spektrofotométer általános alapelveibe és alkalmazásába

A spektrofotométert széles körben használják biológiai, kémiai, klinikai és környezeti kutatásokban.
A spektrofotometria azt méri, hogy mennyi fényt képes felvenni a vegyi anyag, ha egy fénysugarat egy mintán keresztül vezet egy spektrofotométerben.
A kimutatott fényintenzitás mérésével a módszer felhasználható az oldott anyag koncentrációjának meghatározására a mintában.
A spektrofotometria fogalma
A mintába küldött sugárzás fotonnyalábból áll.
Amikor a fotonok találkoznak a mintában levő molekulákkal, a molekulák képesek abszorbeálni néhányukat, csökkentve a fotonok számát a sugárban és csökkentve a detektáló jel intenzitását.
A transzmittancia a mintán áthaladó fény része. Ez a mintán áthaladó fényerősség a beeső fényerősség mellett.
Az abszorbancia ellentétes az áteresztőképességgel, amely megfelel a spektrofotométerrel mért mennyiségnek.
Az abszorbancia alapján az oldatminta koncentrációja meghatározható a Lambert-törvény alapján, amely azt mutatja, hogy lineáris kapcsolat van az abszorbancia és a minta koncentrációja között. A sör Lambert törvény szerint az abszorbancia az abszorpciós együttható szorzata, amely egy adott hullámhosszon az oldott anyag abszorbeált fénymennyiségének és a fény áthaladásának távolságának a mértéke. A minta vagy az utazási távolság és az oldott anyag koncentrációja. Általában az abszorbancia mérésének célja a minta koncentrációjának mérése.
A spektrofotométer alkotóelemei
Minden spektrofotométer egy fényforrásból, egy kollimátorból (lencse vagy egy fókuszáló eszköz az erős és egyenes sugarak átviteléhez), egy monokromátorból a különböző hullámhosszúságú sugarak elválasztásához, valamint egy hosszválasztóból a kívánt hullámhosszú hullám vagy horony kiválasztásához. A videóban bemutatott spektrofotométerben használt fény hullámhossza az ultraibolya és a látható fény tartományában van. A spektrofotométer tartalmaz még egy mintatartót, egy fotodetektorot és egy képernyőt, amely a detektor eredményeit mutatja.
A legújabb spektrofotométer közvetlenül egy számítógéphez van kapcsolva, ahol a kísérleti paraméterek vezérelhetők és az eredmények megjeleníthetők.
A spektrofotométer működési elve
A spektrofotometria elvégzésekor fontos az óvintézkedések meghozatala, például kesztyű viselése, az alkalmazott biológiai vagy kémiai oldat típusától függően.
Kapcsolja be az eszközt, és hagyja, hogy a lámpa és az elektronika felmelegedjen, mielőtt megmérné a minta UV-Vis spektrumát.
Készítsen vakmintát ugyanabból az oldatból, azonos pH-értékkel és hasonló ionerősséggel, de az analizálandó komponensek nélkül; mivel a küvetták és az oldószerek eloszlathatják a fényt, elemezni kell a mintát.
A hagyományos spektrofotométer-mintatartót műanyag és kvarc edények tartására tervezték. Pipettázzunk az eredeti oldatot egy tálba.
Az ujjlenyomatok letörlése és a tál külsõ részeinek fröccsenése után helyezze be a küvettát a mintatartóba, és csukja be a fedél ajtaját.
Soha ne felejtsük el bezárni az ajtót, mert a nyitott spektrofotométer UV-sugárzása károsíthatja a szemét és a bőrt.
Programozza be a mintához továbbítandó kívánt hullámhossz vagy hullámhossz-tartományt. Ez attól függ, hogy a vizsgált komponens milyen hullámhosszon képes abszorbeálni. A gépet ezután nullázza az üres minta megmérésével, amely kivonja az alsó abszorbanciát a mintapuffer miatt.
Attól függően, hogy milyen spektrofotometriai kísérletet végez, a minta mérése előtt szükség lehet egy standard görbe létrehozására, amely alapján meghatározható a mintában elemzett vegyület koncentrációja.
Hagyja, hogy a minta elérje a megfelelő hőmérsékletet, és óvatosan keverje össze, hogy elkerülje a buborékok kialakulását. A mintát ezután közvetlenül hozzáadhatjuk a gép belsejében található tálhoz, és leolvashatjuk.
A minta abszorbanciájának mérése után a kísérletet megfelelően kiszámítják; például a koncentráció vagy az enzimaktivitási szint meghatározására.
Spektrofotométer alkalmazása
A spektrofotométer egyik leggyakoribb felhasználása a sejtsűrűség mérése. A sejtsűrűség mérésével előállíthatjuk a baktériumok logaritmikus növekedési görbéjét, amelyből meghatározható a rekombináns fehérje integrációjának optimális ideje.
A spektrofotométer felhasználható a kémiai reakció sebességének mérésére is. Ebben a kiviteli alakban az abszorbanciát az enzimatikus reakció megfigyelésére használjuk, amely idővel eltűnik egy 452 nm közötti közbenső reakció révén. Ennek az enzimatikus lépésnek a sebessége kiszámítható úgy, hogy az adatokat összekapcsoljuk a megfelelő egyenlettel.
A mikro-spektrofotométer bevezetése kiküszöböli a mintatartó igényét. Ezek a spektrofotométerek felületi feszültséget használnak a minta fenntartására.
A mikrospektrofotométer a legjobb választás a kicsi és drága minták, például biomolekulák, beleértve a fehérjéket és nukleinsavakat, tömegének és koncentrációjának mérésére.
A fehérjék 280 nm-nél történő abszorpciója a triptofánban, tirozinban és fenilalaninban található aromás oldalláncok tartalmától, valamint a két cisztein közötti diszulfidkötéstől függ.
A fehérje koncentrációját a 280 nm-en belüli abszorbanciája és az aminosavak összetételén alapuló abszorpciós együtthatója határozhatja meg.
A DNS és az RNS maximális abszorbanciája 260 nm-en van, amely alapján meg lehet határozni koncentrációjukat. A nukleinsavak tisztaságát az abszorbanciaértékek és a meghatározott hullámhosszok aránya alapján is ki lehet értékelni.