Spektrofotometriás kolorimetriás fehérje mennyiségi meghatározása
A fehérjék általában fehérjék keverékei. A kolorimetriás vizsgálatok a protein összetevőkön alapulnak: Az aminosavak (pl. Tirozin, szerin) egy további kromogén csoporttal vagy festékkel reagálnak színezett anyag előállítására. A színezett anyag koncentrációja közvetlenül kapcsolódik azon aminosavak számához, amelyeket a fehérje reagál, ezáltal a fehérje koncentrációját tükrözi.
Kolorimetriás módszer
Számos módszer létezik, mint a BCA, Bradford és Lowry.
A Lowry módszer: A legkorábbi Biuret-reakció alapján és továbbfejlesztve. A fehérje reagál a Cu2-gyel, hogy kék reakciót eredményezzen. A Lowry módszer azonban érzékenyebb, mint a Biuret. A hátrány az, hogy egymás után több különböző reagenset adunk hozzá; a reakció sokáig tart; érzékeny a nem fehérjékre; az EDTA-t, Triton x-100-at és ammónia-szulfátot tartalmazó fehérjék nem alkalmasak erre a módszerre.
Bicinokininin savas vizsgálata: Ez egy újabb, érzékenyebb fehérje vizsgálat. Az elemzendő fehérje Cu2-gyel reagáltat lúgos oldatban Cu előállítására, amely kelátot képez BCA-val, lila vegyületet alkotva, abszorpciós csúcs 562 nm-en. A vegyület és a fehérje koncentrációja közötti lineáris kapcsolat erős, és a reakció után képződő vegyület nagyon stabil. A Lowry módszerrel szemben a művelet egyszerű és az érzékenység magas. Azonban a Lowry módszerhez hasonlóan érzékeny a fehérjékre és a mosószerekre.
A Bradford módszer: Ennek a módszernek az alapelve, hogy a fehérje reagál a Coomassie Brilliant Blue-el, hogy színes vegyületet kapjon, amely 595 nm-en abszorbeálódik. Legfőbb jellemzője az érzékenysége, amely kétszerese a Lowrynek és a BCA-nak. Egyszerűbb és gyorsabb. Csak egyfajta reakció-reagensre van szüksége. A vegyület 1 óra alatt stabil lehet az eredmény megkönnyítésére; A Lowry-szal szemben a BCA reagál a redukálószerekkel (pl. DTT, merkaptoetanol) kompatibilis. Azonban még mindig érzékeny a mosószerekre. A legfőbb hátrány az, hogy a különböző szabványok nagy eltéréseket eredményezhetnek ugyanazon minta eredményeiben, és nincs összehasonlítható eredmény.
Néhány kutatót, akik először kolorimetrikus mérésekkel vannak kitéve, összezavarhatja a különböző kolorimetriás vizsgálatok eredményei. Milyen módszereket gondolsz, hogy összezavarodnak? Annak a ténynek köszönhetően, hogy a csoportok különböző módon reagáltak, és a kromogén csoportok nem azonosak, többféle módszert alkalmaznak egyidejűleg, hogy az ugyanazon minta koncentrációja következetlen legyen. Például Keller et al. tesztelték a fehérjét az emberi tejben, és megállapította, hogy a Lowry és a BCA által mért koncentráció szignifikánsan magasabb, mint a Bradfordé. A különbség jelentős volt. Még akkor is, ha ugyanazt a mintát meghatározták, az ugyanazon kolorimetriás módszerrel kiválasztott standard minta következetlen, és a koncentráció a vizsgálat után is következetlen. Például, használj Lowry-t, hogy teszteljük a fehérjét a sejthomogenizátumban, standardként BSA-t használva, 1,34 mg / ml-es koncentrációval és egy globulint standardként, 2,64 mg / ml koncentrációval. Ezért a kolorimetriás módszer kiválasztása előtt célszerű a vizsgált minta kémiai összetételére utalni, és szabványosan kémiailag hasonló standard fehérjét találni. Ezenkívül a fehérjék mennyiségi meghatározására szolgáló kolorimetriás módszer gyakran okoz problémákat, mivel a minta abszorbancia értéke túl alacsony, ami nagy különbséget eredményez a mért koncentráció és a tényleges koncentráció között. A legfontosabb kérdés az, hogy az 1011-es spektrofotométer fontos része, a küvettának egy bizonyos felezési ideje van, ezért minden színmérési módszer felsorolja a reakciót. Minden mintát (beleértve a standard mintákat is) ebben az időben kell tesztelni. Ha az idő túl hosszú, a kapott abszorbanciaérték kisebb lesz, és az átalakított koncentrációs érték csökken. Ezenkívül a reakció hőmérséklete, az oldat pH-értéke stb. Mind fontos tényezők, amelyek befolyásolják a kísérletet. Ezenkívül nagyon fontos a műanyag kolorimetria alkalmazása. Kerülje a kvarcból vagy üvegből készült küvetták használatát, mert a szín után a kvarc vagy az üveg színes lesz, ami a minta pontatlan abszorbanciáját eredményezi.
A cég spektrofotométerek értékesítésére szakosodott, üdvözöljük az ügyfeleket, akiknek tanácsadást és vásárlást igényelnek. Örvendetes szolgáltatásokat és minőségi termékeket, valamint alacsonyabb árakat kínálunk Önnek.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com